Tóm tắt
Chiết xuất từ nhau thai (PE) đã được sử dụng như một phương thuốc dân gian tại các nước châu Á. Chiết xuất nhau thai người được sử dụng trên lâm sàng cho điều trị nhăn da nhờ thúc đẩy tái tạo da. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng chiết xuất nhau thai heo (PPE) thúc đẩy sản sinh collagen bởi các nguyên bào sợi da người (NHDFs). Các nguyên bào sợi NHDFs được điều trị với PPE ở nồng độ 12,5-100 mg / ml giúp tăng cường sự phát triển và tiết procollagen C peptide. Chúng tôi cũng thấy rằng biểu hiện của chất nền dịch ngoại bào Metalloproteinase-9 (MMP-9) trong các nguyên bào sợi NHDFs được điều trị PPE đã giảm phụ thuộc vào liều sử dụng. Những kết quả này chỉ ra rằng PPE có thể ảnh hưởng đến nếp nhăn trên khuôn mặt bằng cách tăng cường nguyên bào sợi tăng sinh và tiết collagen trong khi ức chế sự biểu hiện của MMP-9 trong NHDFs.
Giới thiệu
Nhau thai là một cơ quan xuất hiện tạm thời trong thời gian mang thai , là nguồn cung cấp oxy và chất dinh dưỡng để thai nhi phát triển [1] . Nó bị thải ra khỏi cơ thể sau khi sinh và các chất dinh dưỡng có thể được chiết xuất để tạo thành chiết xuất nhau thai (PE) . Chiết xuất nhau thai như báo cáo chứa các enzyme như photphat axit kiềm, glutamic oxalo acetic transaminase , axit nucleic , vitamin, acid amin , steroid , axit béo , và khoáng chất [2] . Chiết xuất nhau thai là một phương thuốc cổ truyền sử dụng cho chữa lành vết thương , vì khả năng kích thích miễn dịch và hoạt động chống viêm , sử dụng như là một thành phần mỹ phẩm bổ sung ở nhiều nước châu Á [3]. Ở châu Á, tiêm dưới da hoặc tiêm bắp dịch chiết nhau thai người PE ( HPE ) , một sản phẩm thủy phân của nhau thai người có tên thương mại Laennec (Japan Bio Products, Tokyo, Nhật Bản ) , đã được sử dụng gần đây để điều trị các rối loạn khác nhau bao gồm các triệu chứng mãn kinh , vết thương không lành, loét giãn tĩnh mạch mãn tính [ 4-7 ] . Hơn nữa, HPE ứng dụng trong lâm sàng và thẩm mỹ được sử dụng để điều trị nếp nhăn da vì khả năng thúc đẩy tái tạo da [ 8,9 ] . HPE là cũng là một trong các thành phần trong thuốc mỡ bôi da vì khả năng thúc đẩy tái tạo da và sự tăng trưởng của các melanocyte cũng như trong điều trị da nhạy cảm như viêm da và bệnh vẩy nến [10].
Gần đây, chiết xuất nhau thai heo PE (PPE) đã được phát triển dưới dạng thực phẩm chức năng cho các mục đích tương tự như HPE. Trong một nghiên cứu trước đây, PPE đã sử dụng để chữa lành vết thương ở chuột với các vết thương do bỏng [11]. Điều trị bằng PPE cũng ức chế sự kích hoạt của các tế bào trình diện kháng nguyên bao gồm các đại thực bào, dẫn đến giảm các cytokine gây viêm, cho thấy một tiềm năng ứng dụng điều trị của PPE trong bệnh viêm da [12]. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi chứng minh PPE dùng đường uống có hiệu quả đáng kể cho việc giảm đầu gối đau ở phụ nữ tiền mãn kinh và mãn kinh. Nếp nhăn là do sự lão hóa, di truyền và các yếu tố môi trường như tia cực tím, thuốc lá và estrogen [15-19]. Trong số những yếu tố này, mức độ nghiêm trọng của các nếp nhăn tương quan mạnh mẽ với tuổi. Ở người, da lão hóa sẽ trở nên mỏng do giảm elastin, glycosamino glycans và collagen.
Collagen là một loại protein dạng sợi chiếm phần lớn trong chất nền ngoại bào và là một thành phần chính của các mô liên kết trong cơ thể con người. Khoảng 3-6% tổng số protein mô trong cơ thể là collagen và các tính chất chức năng của da phụ thuộc vào sự toàn vẹn của collagen trong lớp hạ bì. Thay đổi trong biểu hiện collagen xảy ra trong quá trình lành vết thương,sự phát triển xương mới, và quá trình lão hóa [24]. Vì vậy, việc kiểm soát trao đổi chất collagen có thể có ích cho một loạt các điều trị và ứng dụng mỹ phẩm.
Chúng tôi thấy rằng PPE sử dụng đường uống cho phụ nữ tiền mãn kinh và mãn kinh dẫn đến giảm chiều rộng của các nếp nhăn dưới đây mắt. Tuy nhiên, cơ chế điều tiết tổng hợp collagen trong nguyên bào sợi ở người bằng PPE chưa được làm sáng tỏ chi tiết. Trong này nghiên cứu, chúng tôi thấy rằng PPE kích thích tổng hợp collagen và ức chế tiết một enzyme làm giảm collagen Metalloproteinase (MMP) -9 trong nguyên bào sợi da người (NHDFs).
Vật liệu và phương pháp
PPE
PPE (JBP porcine 100, Tokyo, Nhật Bản) được sử dụng trong nghiên cứu này được cung cấp từ công ty Japan Bio Products. Nhau thai heo được thu thập ở Nhật Bản và được xử lý bằng một protease và khử trùng nhiệt trước khi đông khô, tán nhỏ và đóng viên nang. Các thành phần của viên nang được hòa tan trong nước cất để sử dụng trong các thí nghiệm
Nuôi cấy tế bào
NHDFs được thu thập từ bao quy đầu ở trẻ sơ sinh và mua từ Takara Bio (Shiga, Nhật Bản). Các tế bào được nuôi trong môi trường Dulbecco’s Modified Eagle’s (DMEM; Sigma-Aldrich, St Louis, Mỹ) bổ sung 10% huyết thanh thai bê (FBS) ở 37 ° C với 5% CO2.
Xét nghiệm tăng sinh tế bào
Tăng sinh tế bào được đánh giá bằng một phân tích MTT [25]. NHDFs (1 × 104 tế bào / ml) được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng với DMEM có chứa 10% FBS trong 2 giờ. PPE đã được thêm vào môi trường ở nồng độ khác nhau, và sau đó các tế bào được ủ trong 48 giờ. Môi trường đã được hút và thay thế bằng 100 µl môi trường mới và 20 µl dung dịch MTT (0,5% (w / v) ở Ca2+ / Mg2 + tự dom Phosphate-Buffered Saline [PBS]; Nacarai Tesque, Kyoto, Nhật Bản) mỗi giếng sau 4h ủ. Sau đó, 150 µl dung dịch SDS cũng đã được thêm vào mỗi giếng, tiếp tục ủ 18 h. Các tấm sau đó được lắc trong 15 phút và đọc kết quả hấp thụ tại bước sóng 570-nm.
Đo lượng procollagen Ι C-peptide (PIP) bằng xét nghiệm Enzyme miễn dịch (EIA) PIP đã được sử dụng như một dấu hiệu (marker) cho tiết procollagen. NHDFs (1 × 104 tế bào / ml) được nuôi cấy trong 24 tấm với DMEM chứa 10% FBS. Tại 80% hội lưu, môi trường đã được thay thế bằng DMEM chứa 0,5% FBS, và các tế bào được nuôi cấy qua đêm. Sau đó, tế bào được kích thích với nồng độ khác nhau của PPE, dịch nổi nuôi cấy đã được thu hoạch sau 24-72 h và đông lạnh ở -80 ° C cho đến khi sử dụng. Mức độ PIP trong nước nổi được đo bằng một bộ kit EIA có sẵn (Takara Bio, Shiga, Nhật Bản) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Phân tích Western blot
NHDFs được nuôi cấy trong các đĩa 60 – mm với DMEM chứa 10 % FBS . Phương pháp nuôi cấy các tế bào tương tự như mô tả để xác định mức độ PIP. Tóm lại, sau 72 giờ nuôi cấy, các tế bào được ly giải với một đệm phân tích thay đổi miễn dịch sửa chứa protease và chất ức chế (1 µg/mL aprotinin, 1 µg/mL leupeptin, 1 µg/mL pepstatinA, 100 mM PMSF, 200 mM NaVO3, 100 mMNaF, and 2×complete Mini; (Roche applied science, Mannheim, Germany)) . Dịch ly giải được ly tâm để loại bỏ mảnh vụn tế bào, và dịch nổi được thu thập để thu chiết xuất protein. Nồng độ protein được đo bằng một bộ xét nghiệm protein BCA ( Thermo Fisher Scientific , Hoa Kỳ ) . Mỗi mẫu protein ( 10 mg ) được phân đoạn kích thước bởi điện di gel polyacrylamide SDS sử dụng 12 % gel nhỏ TGX protean ( Bio-Rad Laboratories , CA, USA ) . Protein tách đã được chuyển qua màng poly vinylidene fluoride ( GE Healthcare ,Anh ) . Màng sau được cố định trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng với PBS chứa 5% bột sữa không béo, 0,05 % Tween 20 (PBS -T ) và sau đó ủ với kháng thể gốc pha loãng trong PBS -T ở 4 ° C. Các kháng thể gốc là kháng thể MMP-9 thỏ ( 1:1000 ) và kháng thể β – actin chuột ( 1:5000 ) (Santa Cruz Biotechnology, TX, USA). Màng được rửa nhiều lần với PBS-T và sau đó ủ với kháng thể thứ cấp pha loãng trong PBS-T trong 1 giờ tại nhiệt độ phòng. Kháng thể thứ cấp kháng thể dê kháng kháng thể thỏ IgG Horseradish peroxidase (HRP) (1:2000) và kháng thể lừa con lừa kháng kháng thể chuột IgG-HRP (1:5000) mua từ Santa biotechnology. Màng được rửa nhiều lần với PBS-T và nước Milli-Q. Phản ứng protein đã được hình dung với thuốc thử phát hiện ECL và kỹ thuật tự chụp phóng xạ sử dụng phim chụp phóng xạ hiệu năng cao (GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, England).
Phân tích thống kê
Kết quả được thể hiện bằng trung bình ± Độ lệch chuẩn (SD). Sự khác biệt giữa các nhóm được đánh giá bằng các thử nghiệm trên Wilcox signedrank. Phân tích Mann-Whitney U nonparametric được sử dụng để đánh giá sự khác biệt giữa hai nhóm. P <0,05 được coi là ý nghĩa thống kê.
Kết quả
PPE thúc đẩy tăng sinh NHDF
Các nguyên bào sợi da tổng hợp các protein nền ngoại bào bao gồm collagen đóng một vai trò quan trọng trong việc tái tạo da [26]. Chúng tôi đầu tiên nghiên cứu về ảnh hưởng của PPE trên sự tăng sinh của NHDFs được nuôi cấy. Như được chỉ ra trong Hình 1, NHDFs điều trị bằng 100 µg / mL PPE cho thấy tốc độ tăng sinh cao hơn so với nhóm đối chứng. Khả năng của PPE trong tăng sự phát triển tế bào là liều phụ thuộc vào nồng độ trong khoảng 6,25-100 µg / ml (Hình 1A). Trong 24-72 h nuôi cấy, 50 µg / ml PPE đã tăng cường phát triển tế bào so với trong nhóm đối chứng.
Ảnh hưởng của PPE đến sự tổng hợp PIP
Để khảo sát sự tác động của PPE trên tổng hợp collagen và / hoặc tiết ra bởi các NHDFs, chúng tôi đo lượng PIP trong dịch nổi của các NHDFs sau khi kích thích với PPE. Như minh họa trong Hình 2, các tế bào được điều trị bằng PPE tổng hợp PIP phụ thuộc vào liều PPE. Nồng độ PIP trong dịch nổi tích lũy. đáng kể trong vòng 72 giờ sau khi thêm 50 µg / ml PPE, trong khi đó nồng độ PIP đã giảm ở 200 µg / ml PPE (Hình 2A và 2B).
Ảnh hưởng của PPE trên sự biểu hiện nội bào tế của MMP-9 trong NHDFs
MMP-9 là một thành viên của họ các metalloproteinase có vai trò tổ chức lại chất nền ngoài bào, đã được chứng minh đóng một vai trò quan trọng trong suy thoái collagen [27]. Do đó chúng tôi nghiên cứu tác động của PPE trên MMP-9 biểu hiện trong NHDFs. Sau 72 h nuôi cấy, phân tích Western Blot tiết lộ rằng PPE với nồng độ trong khoảng 12,5-50 µg / ml giảm đáng kể sự biểu hiện MMP-9 phụ thuộc vào liều PPE (Hình 3).
Thảo luận
HPE được sử dụng để bổ sung cho mỹ phẩm chăm sóc da và da bị nám [9]. Nó cũng đã được báo cáo đóng một vai trò trong việc da tái tạo [8,9]. Tuy nhiên, các ứng dụng PPE chưa bao gồm cải thiện sự xuất hiện của nếp nhăn. Được biết, phân tử tiền collagen (procollagen) được tổng hợp trong các nguyên bào sợi [26]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng sự gia tăng của các nguyên bào sợi được tăng cường bởi PPE.
Một nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng PPE kích thích các nguyên bào sợi da vào giai đoạn S và làm tăng mức độ protein yếu tố tăng trưởng tế bào sợi FGF, kết quả này cũng phù hợp với kết quả của chúng tôi.
Chúng tôi cũng thấy rằng PPE tăng đáng kể sản tổng hợp collagen trong NHDFs tại 72 h của văn hóa, cho thấy PPE có ảnh hưởng kích thích đến sản xuất collagen. Collagen da có vai trò trung tâm trong độ bền cơ học của da như một thành phần của chất nền ngoại bào. Lắp ráp cấu thành chủ yếu được khởi xướng bởi sự tăng trưởng yếu tố và kích thích tố như estrogen [28]. Sự suy giảm của da nội dung collagen sau khi mãn kinh là một yếu tố quan trọng trong sự xuất hiện của nếp nhăn. Sự lắp ráp để tạo thành kết cấu của collagen khởi đầu chủ yếu bởi yếu tố tăng trưởng và các hormone ví dụ như Estrogen. Sự suy giảm collagen của da sau mãn kinh là một yếu tố quan trọng trong sự xuất hiện của nếp nhăn. Hơn nữa, có một sự tương quan mạnh mẽ giữa việc mất collagen ở da và thiếu hụt estrogen trong thời kỳ mãn kinh, và điều đó cũng cho thấy rằng thiếu hụt estrogen có thể được tham gia vào việc giảm collagen da, dẫn đến da nhăn ở phụ nữ mãn kinh.
Nghiên cứu gần đây của chúng tôi đã chứng minh rằng phụ nữ được điều trị bằng Liệu pháp thay thế hormon cho thấy giảm đáng kể chiều rộng của các nếp nhăn so với phụ nữ không được điều trị [29]. PPE không ảnh hưởng đến mật độ khoáng của xương hoặc trọng lượng của tử cung ở những con chuột cái đã bị cắt buồng trứng và ở phụ nữ mãn kinh sau 24 tuần điều trị bằng PPE mức độ estrogen huyết thanh hoặc hormone tuyến giáp không bị ảnh hưởng[14]. Điều này cho thấy estrogen và hormon tuyến giáp không tham gia vào các hiệu ứng hoạt tính sinh học qua trung gian PPE . Thật vậy, progesterone và oestradiol ít có ảnh hưởng đến tăng sinh tế bào [11]. Do đó, khả năng cảm ứng tăng sinh tế bào và tổng hợp collagen bởi PPE không gây ra bởi những hormone này. Số lượng collagen dưới da là kết quả tổng hợp và suy thoái. MMPs là một họ các enzym liên quan đến cấu trúc, bao gồm collagenase-1 (MMP-1), collagenase-3 (MMP-13), gelatinase A và B (MMP-2 và MMP-9), stromelysin (MMP-3), và MMP membranetype, có khả năng làm giảm tất cả các thành phần của chất nền ngoại bào như collagen, elastin, fibronectin, proteoglycan, và laminin [27]. Đặc biệt, MMP-1 phá hủy các sợi collagen loại I và loại III, MMP-9 phá hủy các mảnh vỡ collagen và MMP-3 phá hủy collagen loại IV và kích hoạt pro-MMP-1. Trong nghiên cứu này, PPE làm giảm nồng độ protein của MMP-9 trong NHDFs. Vì vậy, kết quả này cho thấy rằng PPE ngăn chặn sự xuống cấp của collagen bằng cách làm giảm sự biểu hiện của protein MMP-9. Để khảo sát mối quan hệ giữa mRNA và sự biểu hiện proteinMMP-9,phản ứng Real- time RT PCR đã được thực hiện. Kết quả là nồng độ của mRNA MMP-9 thấp, trong khi các giá trị biểu hiện của MMP-9 rất khác nhau trong phương pháp RT-PCR. Kết quả chúng tôi quan sát được là PPE có xu hướng ngăn chặn sự biểu hiện mRNA . Một hạn chế của nghiên cứu này là chúng tôi đã không xác định thành phần hoạt động trong PPE có ảnh hưởng đến tổng hợp collagen. Nghiên cứu sâu hơn là cần thiết để xác định thành phần hoạt động trong PPE. Tuy nhiên, các chất này trong PPE có thể sẽ là các phân tử nhỏ bao gồm tripeptides và dipeptides, bởi vì PPE đã thể hiện hoạt tính sinh học qua đường uống để điều trị nếp nhăn, các triệu chứng thời kỳ mãn kinh, và khớp gối [13,14]. Collagen được đặc trưng bởi một cấu trúc ba xoắn ốc với một chuỗi lặp đi lặp lại của Glycine (G)-XY, trong đó amino axit X và Y xuất hiện chủ yếu tương ứng là proline và hydroxyl proline [32]. Togashi và cộng sự đã báo cáo rằng HPE chứa các tripeptides G-X-Y [32]. Các tripeptide G-X-Y đã được báo cáo là có khả năng làm tăng collagen và axit hyaluronic trong các nguyên bào sợi nuôi cấy [33]. Chúng tôi gần đây đã tiến hành phân tích axit amin và thấy rằng PPE chứa proline và hydroxyl proline. Chúng tôi cũng đang tiến hành phân tích các thành phần hoạt động, đặc biệt các peptide trong PPE.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng PPE kích thích sự tăng sinh của NHDFs cũng như tổng hợp collagen và ức chế tổng hợp MMP-9. Các nguyên bào sợi được báo cáo là có khả năng tổng hợp collagen và liên kết các sợ collagen nhỏ thông qua Integrin, từ đó điều chỉnh độ dày của da [34,35]. Khả năng tăng sinh tế bào được điều hòa bởi yếu tố xung quanh, đặc biệt là liên quan đến độ dày lớp hạ bì liên quan đến sự tổng hợp collagen của nguyên bào sợi [36,37].
Do đó, chúng tôi đã thảo luận rằng PPE có tác dụng hiệu quả trong chữa lành vết thương hay nếp nhăn nhờ sự phân chia của các tế bào và collagen được tiết ra bù đắp các khoảng trống của mô. Sử dụng PPE kết hợp với mỹ phẩm trong điều trị nếp nhăn trên mặt có thể mang đến những hiệu quả như điều trị với HPE.
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét